Description

Metodologija za istraživanje „Procjena utjecaja aerosola duhana bez izgaranja na strukturu usne šupljine i njegova usporedba s konvencionalnim duhanskim proizvodima“
Ovo istraživanje provodi se u sklopu projekta „Okolišni čimbenici i mikrobiološke interakcije u strukturi dentalnog biofilma“, Hrvatska zaklada za znanost (IP-2020-02-4027; trajanje 2021.-2025).
U istraživanje su uključeni pacijenti Klinike za dentalnu medicinu Kliničkog bolničkog centra Rijeka koji
ispune i potpišu informirani pristanak. Ovo presječeno istraživanje sa stratificiranim uzorkom obuhvaća
90 ispitanika podijeljenih u 3 skupine. Prvu skupinu od 30 ispitanika čine nepušači (kontrolna skupina),
drugu skupinu osobe eksponirane dimu izgorenog duhana (pušači konvencionalnih cigareta), i treću
skupinu eksponirani aerosolu zagrijanog duhana bez izgaranja (konzumenti sustava zagrijanog duhana
(engl. Tobacco Heating System, THS)). Ispitanici u svim skupinama upareni su prema dobi i spolu.
Uključujući kriterijiza ispitivane skupine pušača konvencionalnih cigareta i pušači duhanskih preparata
bez izgaranja su punoljetnost i pozitivna anamneza konzumacije duhanskih proizvoda (tvornički
proizvedene cigarete s filterom) te negativna anamneza sustavnih bolesti i konzumacije lijekova koji bi
mogli utjecati na imunološki odgovor, salivaciju, osjet mirisa i okusa. Ispitanici su identificirani kao
pušači ako su u upitniku o pušenju označili da su pušači konvencionalnih cigareta ili pušači THS-a te su
potvrdno odgovorili na pitanja ″Jeste li tijekom svog života konzumirali najmanje 100 cigareta?″.
Intenzitet pušenja određen je pomoću indeksa pušenja u čijem se izračunu koriste podaci o dnevno
konzumiranim cigaretama i trajanju navike pušenja u izražene u godinama. Nadalje, pušačima THS se
smatraju osobe koje konzumiraju isključivo duhanske preparate bez izgaranja unazad 6 mjeseci. Iz
istraživanja su isključene trudnice, ispitanici koji su koristili terapiju antibiotika, protugljivičnih lijekova
i antiseptika u zadnjih 30 dana, osobe oboljele od lokalnih stanja (parodontitis, akutni ulceronekrotični
gingivitis, bolesti žlijezda slinovnica, upale usta – erythema exudativum multiforme, pemphigus, lichen
ruber), osobe oboljele od sustavnih bolesti (šećerna bolest, maligne bolesti, arterijska hipertenzija,
gazoezofagealna refluksna bolest, bolesti jetre, srca i bubrega, akutne infektivne bolesti i bolesti
štitnjače, neurodegenerativne bolesti, autoimune bolesti), osobe koje konzumiraju lijekove iz skupina
antikolinergika, antiparkinsonika, antiepileptika, antihistaminika, antidepresiva, diuretika,
antihipertenziva, hipnotika, mišićnih relaksatora, narkotika, simpatomimetica, spazmolitika,
anksiolitika, bronhodilatatora, hipoglikemika, statina, retinoida, analgetika i protuupalnih lijekova,
osobe na kemoterapiji, radioterapiji i biološkoj terapiji, imunokompromitirani i transplantirani
pacijenti, osobe s kemosenzornom disfunkcijom. Kriterij uključena kontrolnih ispitanika je punoljetnost
i negativna anamneza konzumacije duhanskih preparata te negativna anamneza sustavnih/lokalnih
bolesti i konzumacije lijekova koji bi mogli utjecati na imunološki odgovor, salivaciju, osjet mirisa i
okusa, a kriterij isključena za kontrolnu skupinu isti je kao i za testne skupine.
Veličinu uzorka izračunata je na temelju prethodnih saznanja o razini proupalnih citokina u slini pušača
i nepušača. Minimalni uzorak od 18 ispitanika je potreban u ovoj studiji da bi detektirali razliku u razini
IL-1β u slini pušača čija vrijednost iznosi 2,84 pg/mL, a kontrolna skupina 1,43 pg/mL uz standardnu
devijaciju 1,54 u obje skupine, snagu (β) 80% i razinu značajnosti (α) 95%. Ako se očekuje koncentracija
IL-6 u slini pušača 1,68 ± 0,48 te 2,04 u slini nepušača uz snagu (β) od 80% i razinu značajnosti od α=
0,05 potrebno je minimalno 28 ispitanika u svakoj skupini. Odlučeno je stoga regrutirati 30 ispitanika
po skupini.
U bazi podataka od sociodemografskih podataka bilježi se dob u godinama na omjernoj ljestvici, spol
na nominalnoj ljestvici (1=muško, 2=žensko), stupanj obrazovanja na ordinalnoj ljestvici (1=mag,
2=bacc, 3=srednja škola ili manje). Kao dihotomne varijable bilježe se sustavne bolesti, uzimanje
lijekova i specifično antibiotika (0=ne; 1=da). Od pušačkih varijabli bilježi se pripadnost skupini
(1=konzumenti cigareta, 2=nepušači i 3=konzumenti THS), pušački staž (ordinalna ljestvica 1=do 5
godina, 2=do 10 godina, 3= do 15 godina, 4=više od 15 godina), broj cigareta dnevno (omjerna
ljestvica), duljina pušenja u godinama (omjerna ljestvica) te Brinkmanov indeks kao umnožak pušačkog
staža u godinama i dnevnog broja cigareta (omjerna ljestvica te kao ordinalna ljestvica s kategorijama
0= lagani pušač (0-199), 1=umjereni (200-599) i teški pušač (≥600).
Anamestičkim upitnikom prikupljaju se podaci o subjektivnim promjenama, suhoći usta, halitozi,
promjeni okusa, mirisa i pečenju (0=ne, 1=da). Trajanje subjektivnih simptoma rangira se na ordinalnoj
ljestvici: 1=do 6 mjeseci, 2=do 12 mjeseci, 3=preko 12 mjeseci) Intenzitet pečenja izražava se na
vizualnoj analognoj ljestvici (graničnici 0=nema do 10 najgore moguće), lokalizacija: 1=vrh jezika,
2=cijeli jezik, frekvencija: 0=nikad, 1=povremeno te peče li na podražaj, spontano, olakšavaili-ili
pogoršava pečenje hrana/piće, peče li iste jačine, pojačava li se prema večeri (sve dihotomizirano 0=ne,
1=da). Bilježi se samoreportirana promjena okusa, hipogeuzija - slano, slatko i gorko (0=ne, 1=da).
Osobe koje konzumiraju aerosol zagrijanog duhana bez izgaranja bilježi se prijašnji pušački status
(0=nepušači, 1=konvencionalne cigarete, 2=druge vrste), jesu li se nakon prelaska na duhan bez
izgaranja pojavile promjene (0=nema promjena, 1=prisutne promjene, 2=pogoršanje simptoma), te
specifično za okus, halitozu, kašalj (0=nema promjena, 1=prisutne promjene, 2=pogoršanje simptoma).
Svi ispitanici reportiraju stres, depresivnost i anksioznost instrumentima Ljestvica percipiranog stresa
(na omjernoj ljestvici 0-40) i Skala depresivnosti, anksioznosti i stresa (DASS) (omjerna ljestvica 0-40).
Vrijednosti Ljestvice percipiranog stresa prikazuju se i na ordinalnoj ljestvici za kategorije 0=niska razina
stresa (suma 0-13), 1=umjerena razina stresa (14-26) i 2=visoka razina stresa (27-40). Depresivnost će
se prikazati i na ordinalnoj ljestvici u kategoriama 0=bez simptoma depresije (sum 0-9), 1=blagi stupanj
(10-13), 3=umjereni (14-20), 3=teški (21-27) i 4=iznimno težak (sum veća od 28). Stres iz DASS
instrumenta i na ordinalnoj ljestvici s kategorijama 0=bez simptoma stresa (sum 0-14), 1= blagi stupanj
(15-19), 2= umjereni stupanj (19-25), 3-teški stupanj (26-33), 4=iznimno težak stupanj (ukupna suma
veća od 34), a anksioznost u sljedećim kategorijama: 0=bez simptoma anksioznosti (sum 0-7), 1= blagi
stupanj (sum 8-9), 2= umjereni stupanj (sum 10-14), 3-teški stupanj (15-19) i 4=iznimno težak stupanj
(ukupna suma veća od 20).
Ispitanicima se napravi klinički pregled usne šupljine kako bi se utvrdilo postoje li oralne promjene
(atrofija, eksfolijativni stomatitis, protetski stomatitis, erozija/ulkus, morsikacija, obloženi, dlakavi,
geografski jezik). Bilježi se u bazi podatka kao kategorijalne dihotomizirane varijable (0=odsutno,
1=prisutno). Prisutnost promjena oralne sluznice bilježi se i po lokalizaciji (nominalna ljestvica 1=jezik,
2=usna šupljina, 3=oboje, 4= obraz).
Napravi se test lučenja nestimulirane sline metodom pljuvanja tako da se instruira ispitanika da kroz 5
minuta pljuje spontano izlučenu slinu u epruvetu. Test se provoditi u periodu od 9:00 do 11:00, a svi
ispitanici su instruirani da ne piju, ne jedu i ne puše 2h prije samog testiranja. Podatak o kvantumu
salivacije mjeri se na omjernoj ljestvici i izražava u mL/5min te bilježi i kao prisustvo hiposalivacije (0=ne
(<1 mL/5min) i 1=da).
Ispitanicima se uzme obrisak sluznice sa sterilnim štapićem s vatom za detekciju gljiva roda Candida, i
to s obrazne sluznice u slučaju nepostojanja kliničkih znakova infekcije, odnosno određenog dijela
sluznice u slučaju postojanja kliničkih znakova infekcije. Uzorci iz usne šupljine dobiveni obriskom
odmah se nasade standardnim nasađivanjem na kromogenu podlogu Chromagar Candida
(CHROMagar, Paris, Francuska) koji identificira pet vrsta Candide (C. albicans, C.krusei, C. glabrata, C.
tropicalis, Candida druge vrste). Nakon inkubacije (48 sati/ i/37°C) vizualnom tehnikom identificira se
različite vrste kandide i prebroje se kolonije te izraze na omjernoj ljestvici pomoću jedinica formiranja
kolonija (engl. Colony Forming Unit, CFU). Varijabla se i kategorizira (0=nema kolonija; 1=prisutne
kolonije.
Ispitanicima se procijeni prisutnost neugodnog zadaha organoleptičkom metodom (halitoza). Ispitivač
subjektivno ocjenjuje zadah iz otvorenih usta dok ispitanik polako izdiše, a normira se prema
Rosenbergu (0 - nema zamjetnog mirisa, 1- vonj se jedva osjeća, 2- vonj je blag, ali se osjeća, 3 - umjeren
vonj, 4 - jak vonj, 5 - izniman smrad).
Evaluacija olfaktorne funkcije procijeni se pomoću Sniffin' Sticks Screening test (Burghart Messtechnik,
Wedel, Njemačka). Mirisne olovke se postavljaju 2 cm udaljenosti od obje nosnice kroz 3-4 s. Ispitanici
su instruirani da moraju odabrati jednu od četiri ponuđene opcije na kartici proizvođača. Odabrani
odgovori se prenose na ispitnu listu i u konačnici se izračuna ukupni zbir na omjernoj ljestvici.
Vrijednost se izrazi i na ordinalnoj ljestvici kao kategorije: 2=anosmija (0-5), 1=hiponosmija (6-9),
1=normosmija (10-12).
Gustatorno testiranje se provodi pomoću okusnih papirnatih trakica (Taste stripes (Burghart
Messtechnik, Wedel, Njemačka) s četiri osnovna okusa (slatko, slano, gorko, kiselo) u različitim
koncentracijama. Okusne trakice se preporučenim slijedom proizvođača postavljaju se na dorzalnu
površinu jezika, a ispitanik zatim definira jedan od četiri standardna okusa različitih koncentracije.
Rezultati se interpretiraju kao ukupni zbir i pojedinačni zbir za svaki pojedini okus (omjerne ljestvice).
Nepravilno identificirane okusne trakice koriste se za dijagnostiku parageusije, a normativna
klasifikacije definira hipogeuziju (ukupni zbir manji od 9) i totalnu ageuziju (nedostatak osjeta za
najveće koncentracije). Normalne vrijednosti normogeuzije za pojedinačni okus slatkog, slanog i
kiselog su dvije prepoznate trakice, a okus gorkog jedna trakica. Niže vrijednosti od prethodno opisanih
ili kriva identifikacija interpretira se kao hipogeuzija, dok potpuni nedostatak svih koncentracija osjeta
za jedan okus kao parcijalna ageuzija. U bazi su formirane kategorije 0=normalna funkcija (barem dvije
prepoznate trakice za testirani okus), 1=smanjena funkcija (manje od 2 prepoznate trakice).
Sakupljena slina tijekom testa lučenja sline se centrifuga (4000 rpm/20min), supernatant se pohrani u
sterilni kontejner i zamrzne na temperaturu od -80°C do daljnje analize. Analiza uzoraka sline vrši se
ELISA metodom i odrediti će se razine salivarnog IL-2, IL-1ß, IL-6 i TNF-α i 8-OHdG. Rezultat se očita
spektrofotometrom i izrazi u pg/mL na omjernoj ljestvici., Učinak ekspozicije nikotinu na stanje parodontnih tkiva nakon liječenja mehaničkim uklanjanjem naslaga sa i bez korištenja antiseptika u odraslih i starijih oboljelih od parodontitisa: kontrolirani klinički pokus

Istraživanje je dio projektnog projekta Hrvatske zaklade za znanost „Okolišni čimbenici i mikrobiološke interakcije u strukturi dentalnog biofilma“ (IP-2020-02-4027; trajanje 2021.-2025.).

Materijal i metode
Ispitanici
Istraživanje je dizajnu kontrolirani klinički pokus s dvije paralelne skupine. U istraživanje je uključeno 60 osoba s parodontitisom (dobi 29-75 godina), susljednih pacijenta Odjela za parodontologiju Klinike za dentalnu medicinu KBC Rijeka. Kod svih ispitanika je parodontitis potvrđen kliničkim pregledom i radiološkom dijagnostikom. Formirane su dvije skupine temeljene na eksponiranosti nikotinu: I) nepučači i II) pušači, svaka sa po 30 ispitanika (u bazi podataka bilježeni su na nominalnoj ljestvici kao 0=nepušač i 1=pušač). Kod svih ispitanika je provedena incijalna parodontna terapija, s tim da je kod jedne polovica svake skupine dodan oralni antiseptik klorheksidin diglukonat koncentracije 0,12% (Curasept ADS 212, Curaden AG, Švicarska), a kod druge nije. Antispeptik se koristio u obliku gargarizma za kućnu uporabu dva puta dnevno kroz 15 dana. U bazi podataka intervencija je bilježena na nominalnoj ljestvici kao 0=incijalna terapija bez klorheksidina i 1=incijalna terapija s klorheksidinom. Dodatno je formirana varijabla grupa eksponiranost x intervencija (1=nepušač bez CHX; 2=pušač bez CHX, 3=nepušač s CHX, 4=nepušač s CHX).
Uključujući kriteriji: Svi ispitanici u skupini pušača imaju barem 1 godinu pušačkog staža, puše minimalno 10 cigareta dnevno i ne namjeravaju prestati pušiti u naredna 2 mjeseca.
Isključujući kriteriji: Iz istraživanja su isključeni povremeni pušači, pušači cigareta bez filtera i motanog duhana, pušači e-cigareta, pušači sustava zagrijavanja duhana bez izgaranja i pušači koji kombiniraju različite sustave (npr. klasične cigarete i e-cigarete). Također, iz istraživanja su isključene maloljetne osobe, trudnice, pacijenti pod imunosupresivnom terapijom, pacijenti sa sustavnim bolestima koje utječu na parodontna tkiva, pacijenti koji su unazad 6 mjeseci bili pod antibiotskom terapijom, pacijenti koji uzimaju lijekove koji kao nuspojave imaju navedene promjene gingive (antihipertenzivi, antiepileptici...), pacijenti koji su bili u prethodnoj parodontnoj terapiji te pacijenti s ortodontskim napravama ili retainerima.
Klinički pregled i inicijalna parodontna terapija
Postupak obrade svakog ispitanika uključio je uzimanje anamnestičkih podataka, kliničkog pregleda usne šupljine, dijagnostičkih postupaka i provođenja inicijalne parodontne terapije.
Od anamnstičkih podataka bilježeni su dob u godinama (omjerna ljestvica) te spol (dihotomno 0=muški, 1=ženski)
Klinički pregled uključuje pregled svih prisutnih zuba i bilježenje sljedećih parodontnih indeksa:
• dubina sondiranja parodontnog džepa (engl. Pocket Probing Depth, PPD) - mjerenje graduiranom parodontnom sondom od dna džepa do ruba gingive u mm na 6 mjesta na svakom zubu (mezio-bukalno, sredina bukalne plohe, disto-bukalno, disto-oralno, sredina oralne plohe, mezio-oralno). Prosječna vrijednost dubine sondiranja svih zubi koristi se kao mjera intenziteta parodontitisa, mjerena na omjernoj ljestvici. Udio zubi s dubokim džepovima (≥5mm) je mjera opsega parodontne bolesti, mjerena na omjernoj ljestvici.
• krvarenje pri sondiranju (engl. Bleeding on Probing, BoP) – dihotomno bilježenje prisutnosti gingivnog krvarenja (0=odsutno, 1=prisutno) nakon umetanja parodontne sonde u gingivni sulkus na šest mjesta na svakom prisutnom zubu. Udio mjernih mjesta s prisutnim gingivnim krvarenjem u odnosu na ukupni broj mjernih mjesta kvantificira se u postotku u obliku Vrijednosti krvarenja cijelih usta (engl. Full mouth bleeding score, FMBS) i koristi se kao mjera opsega gingivitisa, kvantificirana na omjernoj ljestvici.
• aproksimalni plak indeks (engl. Aproximal Plaque Indeks, API) – dihotomno bilježenje prisutnosti dentobakterijskog plaka (0=odsutno, 1=prisutno) na postraničnim polohama zubi detektirano povlačenjem sonde. Udio mjernih mjesta s prisutnim plakom u odnosu na ukupni broj mjernih mjesta izražava se u postotku u obliku Plak vrijednosti cijelih usta (engl. Full mouth plaque score, FMPS) i koristi se kao mjera stupnja oralne higijene, mjerena na omjernoj ljestvici.
• recesija gingive (engl. Gingival Recessions, GR) mjeri se kao udaljenost od ruba gingive do caklinsko-cementnog spojišta na svakom prisutnom zubu vestibularno i oralno parodontnom sondom u mm. Prosječna vrijednost recesija gingive svih zubi koristi se kao mjera intenziteta gubitka gingivnog tkiva, mjerena na omjernoj ljestvici.
• mobilnost zuba (engl. Tooth Mobility, TM) - mjeri se pomak svakog prisutnog zuba nakon dodira drškom instrumenta u horizontalnom i vertikalnom smjeru, a stupanj pomičnosti bilježi metodom po Milleru na kategorijalnoj ljestvici (0=fiziološka pomičnost; 1=horizontalna pomičnost do 1 mm; 2=horizontalna pomičnost 1-2mm; 3=horizontalna pomičnost veća od 2 ili vertikalna pomičnost). Izračunat je udio zuba s povećanom mobilnošću (broj zubi s kategorijom ≥2 u odnosu na ukupan broj mjerenih zubi) kao mjera opsega gubitka parodontne potpore denticije, mjereno na omjernoj ljestvici.

Za sva mjerenja koristi se milimetarski graduirana PCP-15 UNC (HuFriedy, Chicago, SAD) parodontna sonda.
Nakon bilježenja indeksa provodi se inicijalna parodontna terapija. Koriste se uobičajeni instrumenti i uređaji za uklanjanje zubnih naslaga- ručne Gracey kirete (HuFriedy, Chicago, SAD) i strojni - piezon instrumenti i pjeskara - AIRFLOW Prophylaxis Master (EMS Dental, Nyon, Švicarska).
Svi ispitanici dobili su iste upute u pravilno provođenje oralne higijene, istu pastu za zube, interdentalne četkice i mekanu četkicu za zube (Curaprox, Curadnet, Kriens, Švicarska). Bilježenje indeksa ponovi se nakon 8 tjedana, nakon čega se ponovo uklone zubne naslage. Ispitanici su dalje uključeni u sustav potporne terapije kao i ostali pacijenti Odjela za parodontologiju.

Etički aspekti istraživanja
Ovo istraživanje provodi se u skladu sa svim primjenljivim smjernicama čiji je cilj osigurati pravilno provođenje istraživanja i sigurnost osoba koje sudjeluju u znanstvenom istraživanju poštujući Osnove dobre kliničke prakse. Istraživanjem jei osigurano poštivanje temeljnih etičkih i bioetičkih principa – osobni integritet (autonomnost), pravednost, dobročinstvo i neškodljivost – u skladu s Nürnberškim kodeksom i najnovijom revizijom Helsinške deklaracije s posebnim osvrtom na standarde postavljene za izvođenje kliničkih istraživanja, Zakonom o dentalnoj medicini, Zakonom o zdravstvenoj zaštiti te Zakonom o pravima pacijenata. Osigurava se tajnost podataka i identiteta ispitanika.

Statistička obrada podataka
Za statističku analizu podataka koristi se program JASP (Sveučilište u Amsterdamu, Amsterdam, Nizozemska). Kategorijski podaci prikazuju se apsolutnim i relativnim frekvencijama. Razlike u kategoriijskim vrijednostima analiziraju se pomoću χ2 testa. Normalnost raspodjele podataka na kontinuiranim ljestvicama provjerava se Shapiro-Wilkovljevim testom. Za prikaz tih podataka koristiti će se srednja vrijednost i standardna devijacija (ako postoji normalna razdioba) te medijan i interkvartilni raspon (ako ne postoji normalna razdioba). Razlike između kontinuiranih podataka testiraju se Wilcoxonovim testom (usporedba prije-poslije terapije) te Kruskall- Wallisovim i Mann-Whitneyjevim testom (usporedba između skupina u jednoj vremenskoj točki). Razina značajnosti postavljena je na = 0,05., Učinak upotrebe antiseptika i fluorida tijekom ortodontskog liječenja na radna svojstva NiTi žica u niveliranju zubnih lukova: randomizirani kontrolirani pokus

Istraživanje je dio projektnog projekta Hrvatske zaklade za znanost „Okolišni čimbenici i mikrobiološke interakcije u strukturi dentalnog biofilma“ (IP-2020-02-4027; trajanje 2021.-2025.).

ISPITANICI I METODE
Ustroj studije bio je randomizirani kontrolirani pokus. Istraživanje je provedeno na Klinici za dentalnu medicinu Kliničkog bolničkog centra Rijeka. Obuhvatilo je ispitanike oba spola koji su bili predviđeni za ortodontsku terapiju, adolescente i odrasle osobe, u dobi 12 – 22 godina (57 % žena). Kriterij uključivanja ispitanika bio je prisutnost malokluzije kod koje je indicirana ortodontska terapija fiksnim ortodontskim napravama. Kriterij isključivanja ispitanika bio je prethodno poznata alergija na preparate koji su se koristili u studiji. Izračunano je da bi bilo potrebno minimalno 16 ispitanika po skupini za analizu promjene u obliku zubnog luka (promjena u omjeru širine i dužine) od 0,15 u jednoj vrsti intervencije i 0,05 u drugoj te standardne devijacije od 0,10 u oba eksperimentalna stanja, snagu od 80 % i značajnost α = 0,05. Kalkulirajući stopu odustajanja od 20 % odlučeno je da je optimalno imati po 20 ispitanika u svakoj skupini. Randomizacijski plan generiran je putem komercijalnog softvera (http://www.randomization.com).
Prva je skupina ispitanika tijekom perioda od mjesec dana svakodnevno koristila antiseptik klorheksidin (CHX) u obliku gargarizma s 0,12 % klorheksidin diglukonatom kao aktivnom supstancom (Curasept ADS 212, Curaden, Saronno, Italija), druga skupina gel s visokom koncentracijom fluorida (6150 ppm natrijevog fluorida) Mirafluor-K-gel, Hager Werken, Duisburg, Njemačka), a kontrolna skupina bila je zlatni standard – regularno održavanje oralne higijene četkicom i pastom, samo uz primjenu standardne paste za zube koja sadrži nisku koncentraciju fluorida (1450 ppm) bez dodatnih oralnohigijenskih sredstava. Standardizirao se način održavanja oralne higijene (3 puta dnevno po dvije minute Chartersovom tehnikom). Ispitanici u prvoj i drugoj skupini bili su educirani za korištenje antiseptika CHX-a, odnosno gela s visokom koncentracijom fluorida dva puta dnevno dok bi treći put dnevno prali zube samo četkicom bez dodatnih sredstava za održavanje oralne higijene. Sljedeća 2 mjeseca ispitanici su provodili standardnu higijenu (Charters tehnika, 3 puta dnevno 2 minute zubnom pastom koja sadrži nisku koncentraciju od 1450 ppm fluorida).

Analiza oblika zubnih lukova
Otisci zubnih lukova izliveni su u tvrdoj sadri. Sadreni modeli zubnih lukova izrađeni su i analizirani kada je intraoralno postavljena (T1) i nakon što je u ustima 90 dana stajala žica od NiTi legure 0,508 × 0,508 mm (T2). Promjena je kvantificirana kao razlika u dimenzijama (T2 – T1) širine prednjeg (premolarnog) i stražnjeg (molarnog) dijela zubnog luka te prednje (premolarne) duljine luka u maksili i mandibuli. Promjena je kvantificirana kao razlika u dimenzijama (T2 – T1) u premolarnoj i molarnoj širini zubnog luka te premolarnoj dužini odvojeno za maksilu i mandibulu. Kao mjera za oblik zubnog luka korišten je omjer premolarne širine i dužine. Veća vrijednost označava pravokutni oblik zubnog luka (širi i kraći), a niža vrijednost označava suženi ili jajoliki oblik zubnog luka (uži i izduženi). Osobe koje su analizirale sadrene modele i mehanička svojstva žica bile su zaslijepljene na pripadnost analiziranoj skupini.
Analiza oblika zubnih lukova provedena je u Laboratoriju za kraniodentofacijalnu biometriju Fakulteta dentalne medicine Sveučilišta u Rijeci mjerenjem premolarnih (prednjih) i molarnih (stražnjih) širina zubnih lukova, premolarne dužine te omjera dužine i širine zubnih lukova na sadrenim odljevima čeljusti uz pomoć pomične mjerke i trodimenzionalnog ortodontskog šestara po Korkhausu (Dentaurum, Ispringen, Njemačka). Za određivanje referente točke prednje širine na maksili koristila se najdublja točka transverzalne fisure prvih pretkutnjaka, a za stražnju širinu točka sjecišta transverzalne fisure s bukalnom fisurom prvog trajnog kutnjaka. Na mandibuli je za prednju širinu korištena vestibularna kontaktna točka između prvog i drugog pretkutnjaka, a za stražnju vrh mediobukalne kvržice prvog donjeg trajnog kutnjaka. Dužina zubnog luka definirala se kao dužina okomice na liniju koja povezuje referentne točke prednje širine luka u mediosagitalnoj ravnini. Mjerila se od labijalne površine najanteriornije smještenog središnjeg inciziva.

Etički aspekti istraživanja
Istraživanje je bilo provedeno u skladu sa svim primjenjivim smjernicama uz poštivanje Osnova dobre kliničke prakse. Medicinski podatci prikupljani su u skladu s bioetičkim standardima. Za uključene ispitanike osigurana je privatnost i zaštita tajnosti podataka. U skladu s Nürnberškim kodeksom, najnovijom revizijom Helsinške deklaracije te ostalim mjerodavnim dokumentima osiguralo se poštivanje temeljnih etičkih i bioetičkih principa – osobni integritet (autonomnost, pravednost, dobročinstvo i neškodljivost).
Lokalna etička povjerenstva dala su pozitivno mišljenje o istraživanjima uz pisani informirani pristanak svih ispitanika:
1. Etičko povjerenstvo Kliničkog bolničkog centra Rijeka, ur. broj: 2170-29-02/1-14-2
2. Etičko povjerenstvo Kliničkog bolničkog centra Rijeka, ur. broj: 2170-29-02/1-20-2
3. Etičko povjerenstvo Medicinskog fakulteta u Rijeci, ur. broj: 2170-24-01-17-04
3. Etičko povjerenstvo Medicinskog fakulteta u Rijeci, ur. broj 2170-24-01-14-053.
4. Etičko povjerenstvo Fakulteta dentalne medicine Rijeka, ur. broj: 2107-57-006-20-1

Statistička analiza
Podatci su statistički obrađeni, ovisno o raspodjeli dobivenih podataka. Provjera normalnosti distribucije i homogenosti varijanci unutar skupina učinjena je pomoću Kolmogorov-Smirnovljevog i Shapiro-Wilkovljevog testa. Za podatke koji su slijedili normalnu distribuciju korištena je analiza varijance i Student-Newman-Keuls post-hoc test, a u suprotnom Kruskal-Wallisov test s Mann-Whitneyevim testom za višestruke usporedbe uz Bonferronijevu korekciju. Za analize prije i nakon interevencije korišteni su t-test za zavisne uzorke i Wilcoxonov test. Vrijednosti p < 0,05 smatrale su se statistički značajnima., Utjecaj aerosola nastalog iz sustava za zagrijavanje duhana na mikrobiom supragingivnog
dentalnog biofilma i rizik za karijes zubi
Istraživanje je dio projektnog projekta Hrvatske zaklade za znanost „Okolišni čimbenici i
mikrobiološke interakcije u strukturi dentalnog biofilma“ (IP-2020-02-4027; trajanje 2021.-2025.).
Ispitanici
U presječnoj studiji sudjeluje 69 ispitanika u tri skupine po 23 ispitanika temeljem eksponiranosti
duhanu: 1) konzumenti sustava zagrijavanja duhana bez izgaranja (engl. Tobacco Heating System,
THS), 2) konzumenti dima izgorenog duhana (pušači cigareta) i 3) nepušači. Veličina uzorka
izračunata je na temelju podataka aritmetičke sredine i standardne devijacije Plak vrijednosti
cijelih usta (engl. Full Mouth Plaque Score, FMPS) koji su dobiveni provođenjem pilot studije u
kojoj su prema gore predloženom modelu sudjelovale 3 skupine ispitanika – pušači THS, pušači
cigareta i nepušači. Svaku skupinu činilo je 10 ispitanika. Prema izračunu koji je proveden uz snagu
testa 80% i razinu značajnosti od 0,05 određen je minimalni broj ispitanika po skupinama od 16
(prilikom izračuna korištenjem navedenih podataka dobivenih za skupine nepušača i pušača THS)
odnosno 19 (prilikom izračuna korištenjem navedenih podataka dobivenih za skupine pušača THS
I pušača cigareta).
U istraživanje su uključeni pušači THS-a i pušači cigareta koji konzumiraju isključivo jedan od
navedenih duhanskih proizvoda. Ispitanici su smatrani pušačima ako su u upitniku o pušenju
označili da su pušači cigareta ili pušači THS-a te su potvrdno odgovorili na pitanje ″Jeste li tijekom
svog života konzumirali najmanje 100 cigareta/duhanskih umetaka?″. Nadalje, pušačima THS-a su
se smatrale osobe koje konzumiraju isključivo duhanske preparate bez izgaranja unazad 6 mjeseci.
Isto vrijedi za pušače cigareta koji su prethodno pušili THS. Dodatno, zbog postojanja različitih vrsta
cigareta u ovo istraživanje su uključeni isključivo pušači tvornički proizvedenih cigareta s filterom,
budući da ispitivana skupina koja puši THS koriste duhanske umetke (HEETS) koji su tvornički
proizvedeni i sadrže filtere.
Kontrolnu skupinu nepušača čine ispitanici koji nisu nikada pušili, a po dobi i spolu biti su usklađeni
s ispitivanim skupinama pušača THS i pušača cigareta.
Svi ispitanici prije sudjelovanja u istraživanju ispune i potpišu obrazac informiranog pristanka i
upitnik o pušenju.
Kao kriteriji isključivanja uzeti su u obzir čimbenici koji imaju utjecaja na formiranje biofilma te
proliferaciju bakterijskih vrsta. Stoga su iz istraživanja isključeni pacijenti koji su uzimali antibiotsku
terapiju unazad 3 mjeseca od trenutka uzimanja uzoraka, pacijenti koji svakodnevno koriste oralne
antiseptike, pacijenti koji boluju od sustavnih bolesti kao što su diabetes melitus i autoimune
bolesti (npr. reumatoidni artritis, sustavni lupus erythematosus i sl.), odnosno pacijenti koji
uzimaju kortikosteroidnu ili druge oblike imunološke terapije te pacijenti koji su u aktivnoj
ortodontskoj terapiji. Iz istraživanja su također isključeni pacijenti koji imaju manje od 10 zuba.

Varijable – sociodemografske i pušačke
Sociodemografski podaci i oni o pušenju prikupit će se upitnikom. U bazi podataka od
sociodemografskih podataka bilježi se dob u godinama na omjernoj ljestvici, spol na nominalnoj
ljestvici (1=muško, 2=žensko), stupanj obrazovanja na ordinalnoj ljestvici (0=nezavršena osnovna
škola, 1=završena osnovna škola, 2=trogodišnja srednja škola 4=bacc, 5=mag). Od pušačkih
varijabli bilježi se pripadnost skupini (1=THS, 2=pušači cigareta i 3=nepušači) i pušački staž (broj
godina pušenja, omjerna ljestvica), broj cigareta / duhanskih umetaka dnevno (omjerna ljestvica)
Procjena rizika za karijes
Radi procjene rizika za nastanak novih karijesnih lezija ispitanicima iz svih skupina učinjena je
analiza čimbenika rizika za nastanak karijesa računalnom Cariogram metodom (AppBites, Phristina,
Kosovo) koja uzima u obzir prethodno karijes iskustvo, unos fluorida, pridružene bolesti,
prehrambene navike (količina konzumiranih ugljikohidrata i broj obroka u danu), količinu
dentalnog biofilma, sekreciju stimulirane sline, pH sline i broj kariogenih bakterija – Streptococcus
mutans i Lactobacillus spp. prisutnih u slini.
Čimbenici unosa flourida, pridruženih bolesti te broja obroka u danu procijenjeni su
intervjuiranjem ispitanika. Broj obroka bilježi se ordinalnom ljestvicom kategorijama 0=0-3, 1=4-5,
2=6-7, 3=7+ obroka dnevno). Program fluoridacije kategorijama (0=ne koristi; 1=samo pasta s F;
2=pasta+povremeno profesionalna aplikacija fluorida; 3=pasta+redovita profesionalna aplikacija
fluorida).
Procjena prethodnog iskustva s karijesom vrši se pomoću KEP indeksa zubi (broj zubi zahvaćenih
karijesom, izvađenih kao posljedica karijesa ili tretiranih ispunom kao posljedica karijesa) i KEP
ploha, oba na omjernoj ljestvici. Za izračun Cariograma uspoređuje se KEP indeksa površine zuba
ispitanika s prosječnim KEP indeksom površine zuba lokalne populacije koji se odrediti analizom
podataka iz znanstvene literature.
Količina dentalnog biofilma odredi se pomoću Plak vrijednosti cijelih usta (FMPS), mjerena na
omjernoj ljestvici..
Sekrecija stimulirane sline procijenise pomoću testa kvantuma salivacije. Ispitanicima se prije testa
dade da žvaču kockicu parafina dimenzija 10mm x 10mm x 10mm kroz 30 sekundi kako bi se
stimulirala salivacija te ih se nakon toga uputiti da kroz 5 minuta sakuplja slinu pljuvanjem u
graduiranu epruvetu. Izražava se u mL/min na omjernoj ljestvici. Određuje se pH sline pomoću pH
indikatorskih trakica (raspon pH 4,0-7,0). Od 1mL sline određuje se broja kariogenih bakterija
Streptococcus mutans i Lactobacillus spp. metodom izrade deseterostrukih razrijeđenja te
nasađivanjem na hranjive podloge Mitis salivarius agar (za određivanje broja Streptococcus
mutans) i Ragosa SL agar (za određivanje broja Lactobacillus spp.). Vrijednost se izražava u
jedinicama koje formiraju koloniju (engl. Colony Forming Unit, CFU) po mililitru (CFU/mL) na
omjernoj ljestvici, odnosno u njenoj logaritmiranoj vrijednosti. Određivanje broja salivarnih
laktobacila služi za procjenu dnevnog unosa količine ugljikohidrata u ispitanika.
Računalni program Cariogram koristi prikupljene podatke za izračun pet elemenata izgleda za
nastanak karijesa: 1) izgledi za izbjegavanje nastanka novih karijesnih lezija, 2) izgledi za nastanak
novih karijesnih lezija zbog čimbenika okoline, 3) izgledi za nastanak novih karijesnih lezija zbog
bakterija,4) izgledi za nastanak novih karijesnih lezija zbog podložnosti organizma nastanku
karijesa te 5) izgledi za nastanak novih karijesnih lezija zbog prehrambenih navika. Izgled se
izražava na intervalnoj ljestvici.

Analiza mikrobioma supragingivnog dentalnog biofilma
Uzorkovanje
Uzorci biofilma prikupljaju se u jutarnjim satima (između 8 i 10 sati), a ispitanici su upućeni da taj
dan ujutro ne četkaju zube prije uzimanja uzoraka, a prethodnu večer da zube očetkaju između 20
i 22 sata. Uzimanje uzoraka u jutarnjim satima osigurava približno podjednaku zrelost
supragingivnih dentalnih biofilmova ispitanika kojima se uzimaju uzorci.
Ispitanicima se struganjem s bukalnih i oralnih ploha prvih trajnih kutnjaka u suhom radnom polju
sterilnom parodontnom Gracey kiretom uzima uzorak supragingivnog dentalnog biofilma. Ukoliko
su pacijentu prethodno ekstrahirani prvi trajni kutnjaci, uzorak se uzima s mezijalnog zuba (drugi
pretkutnjak) ili distalnog (drugi trajni kutnjak) zuba prisutnog u ustima ispitanika. Prikupljeni
uzorak se pohrani u sterilnu Eppendorf epruvetu volumena 1,5 mL koja sadrži medij za pohranu
(750 µL Tris-EDTA puferske otopine (pH=7,4) + 100 µL 0,5M NaOH). Prikupljeni uzorci se skladište
na -20 °C do trenutka kada će se iz uzoraka vršiti izolacija bakterijske DNK.
Ekstrakcija nukleinskih kiselina DNK
DNK se izolira iz prikupljenih uzoraka biofilma pomoću komercijalno dostupnog kita Nucleospin
Tissue kit (Macherey Nagel, Duren, Njemačka) po modificiranom protokolu za bakterije. Uzorci
biofilma u Eppendorf tubama od 1.5 mL se centrifugiraju 15 min / 15000 rpm te se odstrani
supernatant i ostaviti oko 50 μL sedimenta. Sediment se potom resuspendira u 250 μL
pripremljenog G+ lizirajućeg pufera (prema modificiranom protokolu proizvođača za bakterije).
Dobivena suspenzija se kružno miješa u Vortex mješalici se nakon toga doda 40 μL svježe
pripremljene otopine lizozima (također prema uputi proizvođača). Potom slijedi inkubacija na
37°C/1h, dodatak 30 μL proteinaze K te inkubacija na 56°C/2h. Nakon inkubacije se u uzorak doda
400 μL B3 pufera te se kružno miješa u Vortex mješalici i još jednom inkubira na 70/15 min. Nakon
toga se precipitirati DNK sa 400 μL ohlađenog 98 % etanola. Dalje se slijedi protokol proizvođača
te se na finalnom koraku smanjiti elucijski volumen na 50 μL BE. Koncentracija i čistoća genomske
DNA odredi se pomoću Qubit fluorometra.
Sekvencioniranje sljedeće generacije (engl. next generation sequencing, NGS)
Uzorci svake od istraživanih grupa pripreme se za daljnji postupak NGS-a. Ion torrent tehnologija
NGS bazira se na tehnologiji semikonduktorskih čipova te detekciji promjene pH tijekom
inkorporacije pojedinog nukleotida u sekvencijskim reakcijama. Pripremljene knjižnice se
fragmentiraju te se pojedinačni fragment poveže na 1 Iontorrent kuglicu te amplificira dok kuglice
nisu pune, svaka od kuglica potom sjeda u milione jažica na čipu. Čip se tijekom sekvenciranja
prelijeva otopinom jednog od nukleotida A,T,C ili G te se promjena pH detektira kao taj nukleotid
u pojedinačnoj jažici te pretvara u digitalni signal A,T,C ili G. Amplificira se u 2.-9. hipervarijabilne
regije 16s rRNK gena s Ion 16S Metagenomics kitom (ThermoFisher, Waltham, SAD) prema
uputama proizvođača. Nakon toga se pročiste te udruže amplikoni 2.-9. hipervarijabilne regije 16s
rRNK svakog od uzorka te izmjeri koncentracija. 150 ng svakog od udruženih amplikona se koristiti
za izradu barkodiranih knjižnica pomoću Ion Plus Fragment Library kita (ThermoFisher, Waltham,
SAD) prema uputama proizvođača. Nakon toga se pripremljene knjižnice pročiste od nevezanih
adaptera i barkodova. Koncentracije barkodiranih knjižnica provjeri se pomoću Ion Universal
Library Quantitation kita (ThermoFisher, Waltham, SAD). Zatim slijedi emulzijski PCR s 10 pM
razrjeđenjem knjižnica svih uzoraka pooliranih u 12 µL te priprema osnovnog predloška za
sekvenciranje s Ion OneTouch™ 2 System uređajom te Ion PGM™ Hi-Q View Kitom (ThermoFisher,
Waltham, SAD). Koncentriranje Ion Sphere kuglica-ISP (ispiranje praznih i poliklonalnih ISP) radi se
s Ion OneTouch ES kitom te instrumentom Ion OneTouch 2 (ThermoFisher, Waltham USA), prema
uputama proizvođača. Sekvenciranje se potom napravi s Ion PGM™ Hi-Q View Sequencing Kitom
na Ion PGM™ System uređaju koristeći Ion 316™čip. Analiza dobivenih rezultata učini se pomoću
IonReporter softvera.

Statistička obrada podataka
Statistička obradba podataka provodi se uz pomoć statističkog programa IBM SPSS Statistics 29
(IBM, New York, SAD). Odabir mjera centralne tendencije i mjera varijabilnosti za ispitivane
varijabli čije vrijednosti pripadaju u intervalnu mjernu ljestvicu dob utvrdi se pomoću KolmogorovSmirinovljeva testa. Za varijable koje imaju normalnu raspodjelu podaci se prikazuju aritmetičkom
sredinom i standardnom devijacijom, a za one koje nemaju koristi se medijan i interkvartilni raspon
(25ta-75ta percentila). Podaci koji pripadaju u ordinalnu ili nominalnu mjernu ljestvicu prikazuju
se frekvencijama i/ili postotnim udjelima. Komparativne statističke analize provode se
jednosmjernom analizom varijanci (one-way ANOVA), ili Mann-Whitneyevim testom za podatke
intervalne mjerne ljestvice te χ2 testom, Fisherovim egzaktnim testom ili z-testom za proporcije
za podatke omjerne i nominalne mjerne ljestvice. U svim testovima rezultati se smatraju statistički
značajnima na razini p<0,05.
Statističku obradu podataka dobivenih metodom sekvencioniranja iduće generacije (NGS) izvrši
bioinformatičar pomoću pomoću IonReporter softvera, Učinak aerosola zagrijanog duhana i dima izgorenog duhana na stanje parodonta u odraslih u usporedbi s nepušačima: presječna studija

Istraživanje je dio projektnog projekta Hrvatske zaklade za znanost „Okolišni čimbenici i mikrobiološke interakcije u strukturi dentalnog biofilma“ (IP-2020-02-4027; trajanje 2021.-2025.).

Materijal i metode
Ustroj istraživanja: presječna studija s prigodnim uzorkom 66 konsekutivnih Klinike za dentalnu medicinu Kliničkog Bolničkog centra Rijeka koji dolaze na prvi pregled na Odjel za parodontologiju, Odjel za oralnu medicinu te Odjel za dentalnu patologiju i endodonciju. Formirane su tri skupine (svaka N=22): I) ispitanici koji puše samo klasične cigarete, II) korisnici uređaja za zagrijavanje duhana (THS) tj. konzumenti IQOS bezdimnih cigareta i III) ispitanici koji nikad nisu pušili klasične cigarete niti koristili THS sustav, odnosno imaju status nepušača. Najprije je formirana skupina korisnika IQOS-a, budući da su oni rjeđi, a potom su joj upareni po dobi i spolu s nepušači i pušačimi cigareta. Veličina uzorka od 22 po skupini izračunata je power analizom na temelju predhodnih rezultata istraživanja na nepušačima i pušačima cigareta i električnih cigareta. Za uočavanje efekta f = 0,4, uz snagu testa od 0,8 i razinu značajnosti od 0,05 minimalna veličina uzorka za istraživanje je 66 ispitanika (22 po skupini). Analiza je napravljena u softveru G*Power, 3.1.9.4. (Sveučilište Heinricha Heinea u Düsseldorfu, Düsseldorf, Njemačka).
Kriteriji uključnja: općemedicinski zdravi, zdrave sluznice usne šupljine (odsutstvo bilo kakvih lezija ispod, u razini i iznad razine oralne sluznice) i saniranog zubala, minimalno 20 zuba u usnoj šupljini, pušači klasičnih cigareta ili bezdimnih cigareta najmanje 1 godinu i da puše ≥ 5 cigareta ili duhanskih umetaka bezdimnih cigareta THS sustava dnevno.
Kriteriji isključivanja: maloljetnici, trudnice, ispitanici koji koriste oralne probiotike, ispitanici koji su unatrag šest mjeseci bili pod antibiotskom terapijom, ispitanici koji svakodnevno koriste oralne antiseptike na bazi klorheksidina, ispitanici pod imunosupresivnom terapijom, ispitanici pod bilo kakvom medikamentoznom terapijom te ispitanici koji su bili u predhodnoj parodontnoj terapiji.
Svi ispitanici ispunjavajui upitnik o parodontnom zdravlju, pušačkom stažu i simptomima koje osjećaju zbog korištenja cigareta ili duhanskih umetaka THS sustava.
Postupak obrade svakog ispitanika sastoji se iz uzimanja anamnestičkih podataka, kliničkog pregleda usne šupljine, mjerenja parodontnih indeksa te uzimanje brisa iz gingivnih sulkusa ili parodontnih džepova.
Od anamnestičkih podataka bilježeni su dob u godinama (omjerna ljestvica i dihotmizirano 0= <40; 1=>41) te spol (dihotomno 0=muški, 1=ženski). Pripadnost eksponiranoj skupini bilježit će se na nominalnoj ljestvici kategorijama 0=nepušač, 1=pušač cigareta; 2=korisnik IQOS).
Upitnikom će se prikupljati podaci o pušačkom stažu i simptomatologiji (upitnik je na kraju ovog dokumenta).
Klinički pregled uključuje pregled svih prisutnih zuba izuzem trećih molara i bilježenje broja prisutnih zubi (omjerna ljestvica). Bilježe se sljedeći parodontnih indeksa korištenjem milimetarski graduirane parodontne sonde PCP-15 UNC (HuFriedy, Chicago, SAD):
• dubina sondiranja parodontnog džepa (engl. Pocket Probing Depth, PPD) - mjerenje graduiranom parodontnom sondom od dna džepa do ruba gingive u mm na 6 mjesta na svakom zubu (mezio-bukalno, sredina bukalne plohe, disto-bukalno, disto-oralno, sredina oralne plohe, mezio-oralno). Prosječna vrijednost dubine sondiranja svih zubi koristi se kao mjera intenziteta parodontitisa, mjerena na omjernoj ljestvici. Udio zubi s dubokim džepovima (≥5mm) je mjera opsega parodontne bolesti, mjerena na omjernoj ljestvici.
• krvarenje pri sondiranju (engl. Bleeding on Probing, BoP) – dihotomno bilježenje prisutnosti gingivnog krvarenja (0=odsutno, 1=prisutno) nakon umetanja parodontne sonde u gingivni sulkus na 6 mjesta na svakom zubu (mezio-bukalno, sredina bukalne plohe, disto-bukalno, disto-oralno, sredina oralne plohe, mezio-oralno). Udio mjernih mjesta s prisutnim gingivnim krvarenjem u odnosu na ukupni broj mjernih mjesta kvantificira se u postotku u obliku Vrijednosti krvarenja cijelih usta (engl. Full mouth bleeding score, FMBS) i koristi se kao mjera opsega gingivitisa, kvantificirana na omjernoj ljestvici.
• Prisutnost plaka na površini zuba se određuje pomoću parodontne sonde na način da se parodontna sonda povuče uzduž aproksimalnih i epigingivnih ploha zuba te se postojanje ili odsutstvo plaka dihotomno bilježi (0=odsutno, 1=prisutno). Udio mjernih mjesta s prisutnim plakom u odnosu na ukupni broj mjernih mjesta izražava se u postotku u obliku Plak vrijednosti cijelih usta (engl. Full mouth plaque score, FMPS) i koristi se kao mjera stupnja oralne higijene, mjerena na omjernoj ljestvici.
• recesija gingive (engl. Gingival Recessions, GR) mjeri se kao udaljenost od ruba gingive do caklinsko-cementnog spojišta na vestibularnoj i oralnoj plohi zuba parodontnom sondom u mm. Prosječna vrijednost recesija gingive svih zubi koristi se kao mjera intenziteta gubitka gingivnog tkiva, mjerena na omjernoj ljestvici.
• gubitak parodontnog pričvrska (engl. Clinical Attachment Loss, CAL) mjeri se u milimetrima od caklinsko-cementnog spojišta do dna sulkusa / džepa.
• mobilnost zuba (engl. Tooth Mobility, TM) - mjeri se pomak svakog prisutnog zuba nakon dodira drškom parodontne sonde i ogledalca u horizontalnom i vertikalnom smjeru, a stupanj pomičnosti bilježi metodom po Milleru na kategorijalnoj ljestvici (0=fiziološka pomičnost; 1=horizontalna pomičnost do 1 mm; 2=horizontalna pomičnost 1-2mm; 3=horizontalna pomičnost veća od 2 ili vertikalna pomičnost). Izračunat je udio zuba s povećanom mobilnošću (broj zubi s kategorijom ≥2 u odnosu na ukupan broj mjerenih zubi) kao mjera opsega gubitka parodontne potpore denticije, mjereno na omjernoj ljestvici.
• Zahvaćenost račvališta korijenova zubi (engl Furcation Defect, FD) – mjeri se parodontnom sondom i bilježi na ordinalnoj skali kategorijama po Hampu (0=nije zahvaćeno račvalište, 1=horizontalna zahvaćenost furkacije (<3mm), 2=horizontalno zahvaćena furkacija >3mm, 3=u potpunosti zahvaćeno račvalište – sonda prolazi s jedne na drugu stranu).

Analiza mikrobioma subgingivnog dentalnog biofilma
Uzorkovanje
Iz nasumično pet odabranih gingivnih sulkusa ili parodontnih džepova pet različitih zuba uzima se bris za mikrobiološku analizu pomoću papirnatog štapića i pohranjuje u sterilnu Eppendorf epruvetu volumena 1.5 ml bez medija. Zubi se postave u suho radno polje (postav pamučnih rolica u područje izvodnih kanala velikih žlijezda slinovnica i aspiratora u dno usne šupljine, ispod jezika) da se spriječi kontaminacija papirnatih štapića slinom, potom se zubi dodatno posuše komprimiranim zrakom. Papirnati štapić veličine 45 (Roeko #45 Dental Paper Point, Coltene Whaladent, USA) umetne se u gingivni sulkus ili parodontni džep, sačeka 30 sekundi te odlaže u Eppendorf epruvetu. Eppendorf epruveta tada se pohranjuje na temperaturu od -20 stupnjeva. Uzorci se skladište na toj temperaturi do trenutka kada se vrši izolacija bakterijske DNK.

Ekstrakcija nukleinskih kiselina DNK
DNK se izolira iz prikupljenih uzoraka biofilma pomoću komercijalno dostupnog kita Nucleospin Tissue kit (Macherey Nagel, Duren, Njemačka) po modificiranom protokolu za bakterije. Uzorci biofilma u Eppendorf tubama od 1.5 mL se resuspendiraju u 200 μL pripremljenog G+ lizirajućeg pufera. Dobivena suspenzija vorteksira se i nakon toga doda 40 μL svježe pripremljene otopine lizozima (također prema uputi proizvođača). Potom slijedi inkubacija na 37°C/1h na termomikseru uz miješanje/850 rpm, potom se dodaje 40 μL proteinaze K te se suspenzija inkubira 56°C/2 h (na termomikseru uz miješanje/850 rpm). Nakon toga doda se 300 μL B3 pufera te inkubira na 70°C/10 min. Nakon što se Eppendorf tube malo ohlade, slijedi precipitacija DNK sa 300 μL ohlađenog 98 % etanola. Dalje se slijedi protokol proizvođača te se na finalnom koraku smanji elucijski volumen na 50 μL BE. Koncentracija i čistoća genomske DNA odredi se pomoću Qubit fluorometra.

Sekvencioniranje sljedeće generacije (engl. next generation sequencing, NGS)
Uzorci svake od istraživanih grupa pripreme se za daljnji postupak NGS-a. Ion torrent tehnologija NGS bazira se na tehnologiji semikonduktorskih čipova te detekciji promjene pH tijekom inkorporacije pojedinog nukleotida u sekvencijskim reakcijama. Pripremljene knjižnice se fragmentiraju te se pojedinačni fragment poveže na 1 Iontorrent kuglicu te amplificira dok kuglice nisu pune, svaka od kuglica potom sjeda u milione jažica na čipu. Čip se tijekom sekvenciranja prelijeva otopinom jednog od nukleotida A,T,C ili G te se promjena pH detektira kao taj nukleotid u pojedinačnoj jažici te pretvara u digitalni signal A,T,C ili G. Amplificira se u 2.-9. hipervarijabilne regije 16s rRNK gena s Ion 16S Metagenomics kitom (ThermoFisher, Waltham, SAD) prema uputama proizvođača. Nakon toga se pročiste te udruže amplikoni 2.-9. hipervarijabilne regije 16s rRNK svakog od uzorka te izmjeri koncentracija. 150 ng svakog od udruženih amplikona se koristiti za izradu barkodiranih knjižnica pomoću Ion Plus Fragment Library kita (ThermoFisher, Waltham, SAD) prema uputama proizvođača. Nakon toga se pripremljene knjižnice pročiste od nevezanih adaptera i barkodova. Koncentracije barkodiranih knjižnica provjeri se pomoću Ion Universal Library Quantitation kita (ThermoFisher, Waltham, SAD). Zatim slijedi emulzijski PCR s 10 pM razrjeđenjem knjižnica svih uzoraka pooliranih u 12 µL te priprema osnovnog predloška za sekvenciranje s Ion OneTouch™ 2 System uređajom te Ion PGM™ Hi-Q View Kitom (ThermoFisher, Waltham, SAD). Koncentriranje Ion Sphere kuglica-ISP (ispiranje praznih i poliklonalnih ISP) radi se s Ion OneTouch ES kitom te instrumentom Ion OneTouch 2 (ThermoFisher, Waltham USA), prema uputama proizvođača. Sekvenciranje se potom napravi s Ion PGM™ Hi-Q View Sequencing Kitom na Ion PGM™ System uređaju koristeći Ion 316™čip. Analiza dobivenih rezultata učini se pomoću IonReporter softvera. Krajnji rezultat analize je identifikacija roda i vrste bakterijske DNK.

Statistička obrada podataka
Kategorijski podatci predstave se apsolutnim i relativnim frekvencijama. Numerički podatci opisuju se aritmetičkom sredinom i standardnom devijacijom u slučaju raspodjela koje slijede normalnu, a u ostalim slučajevima medijanom i granicama interkvartilnog raspona. Razlike kategorijskih varijabli testiraju se χ2 testom i Fisherovim egzaktnim testom. Normalnost raspodjele numeričkih varijabli testira se Shapiro-Wilkovljevim testom. Razlike normalno raspodijeljenih numeričkih varijabli između dviju nezavisnih skupina testira se Studentovim t-testom, a u slučaju odstupanja od normalne raspodjele Mann-Whitneyevim U testom, dok se u slučaju 3 i više skupina testira analizom varijance (ANOVA i kao post-hoc Bonferonni i Sheffe test), a u slučaju odstupanja od normalne raspodjele Kruskal-Wallisovim testom (uz post-hoc Conover test). Povezanost normalno raspodijeljenih numeričkih varijabli ocijeni se Pearsonovim koeficijentom korelacije r, a u slučaju odstupanja od normalne raspodjele Spearmanovim koeficijentom korelacije ρ. Logističkom regresijom (bivarijatna i multivarijatna) ispita se koji su prediktori značajni u predikciji parodontne bolesti (većeg gubitka pričvrska). Sve p vrijednosti su dvostrane. Razina značajnosti postavi se na p=0,05. Za statističku analizu koriste se statistički programi MedCalc Statistical Software version 19.0.5 (MedCalc Software bvba, Ostend, Belgium) i SPSS (inačica 16.0, SPSS Inc., Chicago, IL, SAD).
Statističku obradu podataka dobivenih metodom sekvencioniranja iduće generacije (NGS) izvrši će bioinformatičar pomoću Ion Reporter softvera.

Etički aspekt istraživanja
Ovo istraživanje se provodi u skladu sa svim primjenjivim smjernicama, čiji je cilj osigurati pravilno provođenje istraživanja i sigurnost osoba koje sudjeluju u ovom znanstvenom istraživanju poštujući Osnove dobre kliničke prakse. Istraživanjem će biti osigurano poštivanje temeljnih etičkih i bioetičkih principa-osobni integritet (autonomnost), pravednost, dobročinstvo i neškodljivost- u skladu s Nürnberškim kodeksom i nanovijom revizijom Helsinške dekaracije s posebnim osvrtom na standarde postavljene za izvođenje kliničkih istraživanja, Zakonom o dentalnoj medicini, Zakonom o zdravstvenoj zaštiti te Zakonom o pravima pacijenata. Svaki ispitanik ispunjava i potpisuje informirani pristanak kojim pristaje na sudjelovanje u istraživanju i uporabu podataka prikupljenih kliničkim pregledom i mikrobiološkom analizom te upitnicima u znanstvene svrhe., Struktura supragingivnog dentalnog biofilma i kontrola biofilma tijekom ortodontskog liječenja fiksnom metalnon ortodontskom napravom: randomizirani kontrolirani pokus

Istraživanje je dio projektnog projekta Hrvatske zaklade za znanost „Okolišni čimbenici i mikrobiološke interakcije u strukturi dentalnog biofilma“ (IP-2020-02-4027; trajanje 2021.-2025.).

ISPITANICI I METODE
Ustroj studije bio je randomizirani kontrolirani pokus. Istraživanje je provedeno na Klinici za dentalnu medicinu Kliničkog bolničkog centra Rijeka. Obuhvatilo je ispitanike oba spola koji su bili predviđeni za ortodontsku terapiju, adolescente i odrasle osobe, u dobi 12 – 22 godina (57 % žena). Kriterij uključivanja ispitanika bio je prisutnost malokluzije kod koje je indicirana ortodontska terapija fiksnim ortodontskim napravama. Kriterij isključivanja ispitanika bio je prethodno poznata alergija na preparate koji su se koristili u studiji. Izračunano je da bi za analizu promjene bakterijskog profila bilo potrebno minimalno 16 ispitanika po skupini ako se očekuje povećanje brojnosti jedne vrste bakterija od 3 ciklusa potrebna za detekciju DNK bakterije PCR metodom kod jednog eksperimentalnog stanja i smanjenje od 2 kod drugog eksperimentalnog stanja uz standardnu devijaciju od 5 u oba, snagu od 80 % i značajnost α = 0,05. Kalkulirajući stopu odustajanja od 20 % odlučeno je da je optimalno imati po 20 ispitanika u svakoj skupini.
Randomizacijski plan generiran je putem komercijalnog softvera (http://www.randomization.com).
Prva je skupina ispitanika tijekom perioda od mjesec dana svakodnevno koristila antiseptik klorheksidin (CHX) u obliku gargarizma s 0,12 % klorheksidin diglukonatom kao aktivnom supstancom (Curasept ADS 212, Curaden, Saronno, Italija), druga skupina gel s visokom koncentracijom fluorida (6150 ppm natrijevog fluorida) Mirafluor-K-gel, Hager Werken, Duisburg, Njemačka), a kontrolna skupina bila je zlatni standard – regularno održavanje oralne higijene četkicom i pastom, samo uz primjenu standardne paste za zube koja sadrži nisku koncentraciju fluorida (1450 ppm) bez dodatnih oralnohigijenskih sredstava. Standardizirao se način održavanja oralne higijene (3 puta dnevno po dvije minute Chartersovom tehnikom). Ispitanici u prvoj i drugoj skupini bili su educirani za korištenje antiseptika CHX-a, odnosno gela s visokom koncentracijom fluorida dva puta dnevno dok bi treći put dnevno prali zube samo četkicom bez dodatnih sredstava za održavanje oralne higijene. Sljedeća 2 mjeseca ispitanici su provodili standardnu higijenu (Charters tehnika, 3 puta dnevno 2 minute zubnom pastom koja sadrži nisku koncentraciju od 1450 ppm fluorida).

Intenzitet nakupljanja dentalnog biofilma, opseg gingivitisa i pH biofilma
Prije početka ortodontske terapije izmjeren je intraoralni intenzitet nakupljanja dentalnog biofilma, opseg gingivitisa, pH-vrijednost biofilma te je sakupljen biofilm s površina zubi.
Intenzitet nakupljanja dentalnog biofilma kvantificirao se na kruni zuba pomoću originalnog Silness-Loeovog indeksa (kategorije 0 – 3; 0 = bez biofilma, 1 = otoci dentalnog biofilma, 2 = kontinuirana linija biofilma manja od 1 milimetra, 3 = kontinuirana linija biofilma veća od 1 milimetra) te pomoću Williamsove modifikacije za osobe u ortodontskoj terapiji (prosjek uzorkovanja s četiri strane bravice ili cjevčice zalijepljene na bukalnoj plohi zuba: incizalno, gingivalno, mezijalno i distalno). Za intenzitet nakupljanja biofilma po osobi uzet je prosjek navedenih mjerenja na referentnim zubima 16, 12, 24, 36, 32, 44 na ljestvici 0 – 3.
Opseg gingivitisa kvantificiran je pomoću Indeksa krvarenja gingive cijelih usta kao udio mjesta s krvarenjem u ukupnom broju mjernih mjesta (na ljestvici od 0 do 100 %, odnosno za potrebe statističke analize na ljestvici od 0 do 1). Sondiranje parodontnom sondom rađeno je na trima mjestima s vestibularne strane svakog zuba.
Vrijednost pH supragingivnog dentalnog biofilma kvantificirana je kolorimetrijskim testom s pH ljestvicom u rasponu od 4 do 7 (Spezialindikator D-6100, Merck, Darmstadt, Njemačka). Biofilm je sastrugan s površine zuba Gracey kiretom (LM-instruments, Pargas, Finska) pazeći da se pritom ne izazove krvarenje gingive te je nanesen na indikatorsku traku, zasebno na jednom mjernom mjestu u maksili i jednom u mandibuli. Prosjek mjerenja u maksili i mandibuli korišten je za analizu.
Dentalni biofilm skupljen je s površina zubi sterilnom kiretom i pohranjen u plastične epruvete u mediju Tris-EDTA (7,4 ± 0,2) + 0,5 M NaOH (Sigma Aldrich, St. Louis, SAD) te tako pohranjen u Biobanku dentooralnih i periorialnih biouzoraka Biobanke TransMedRi na -80 °C.
Ispitanicima je nakon toga postavljena metalna fiksna naprava preskripcije MBT 0,022' (American Orthodontics, Sheboygan, SAD) te su tijekom prosječno 6 mjeseci horizontalno nivelirani zubi pomoću NiTi 0,014''/0,35 mm i 0,016 × 0,022''/0,41 × 0,56 mm (koji je ostavljen na mjestu 90 dana). Sastav legure bio je w(Ni) = 50,4 % i w(Ti) = 49,6 %. Nakon poravnavanja zubi uzeti su alginatni otisci zubnih lukova, zabilježeni intraoralni indeksi (stupanj nakupljanja dentalnog biofilma i opseg gingivitisa) te pH biofilma. U istoj sesiji umetnut je NiTi dimenzija 0,020 x 0,020“/0,508 × 0,508 mm (BioForce PLUS, Dentsply GAC International, Islandia, SAD) te se pacijente eksponiralo jednom od eksperimentalnih sredstava.
Nakon mjesec dana sakupljen je biofilm, zabilježeni su intraoralni indeksi nakupljanja dentalnog biofilma i opseg gingivitisa te izmjerena pH-vrijednost biofilma. Žičani su lukovi u ustima ostavljeni još dva mjeseca kako bi se osiguralo dovoljno vremena da se pomicanjem zubi eksponira utjecaj na razvoj zubnih lukova.

Izolacija DNK
DNK je izolirana iz prikupljenih uzoraka supragingivnog dentalnog biofilma pomoću komercijalno dostupnog kita – Nucleospin Tissue kit (Macherey Nagel, Duren, Njemačka) po modificiranom protokolu za bakterije. Uzorci biofilma u Eppendorf tubama od 1,5 mL su centrifugirani 15 min/15000 rpm, te je odstranjen supernatant i ostavljeno je oko 50 μL sedimenta. Sediment se potom resuspendirao u 250 μL pripremljenog G+ lizirajućeg pufera (pripremljen prema modificiranom protokolu proizvođača za bakterije). Sve je kružno miješano u Vortex miješalici te dodano 40 μL svježe pripremljene otopine lizozima (također prema uputi proizvođača). Slijedila je inkubacija na 37 °C/1 h, dodatak 30 μL proteinaze K te inkubacija na 56 °C/2 h. Nakon inkubacije je u uzorak dodano 400 μL B3 pufera te je kružno miješan u Vortex miješalici i još je jednom inkubirao na 70°C/15 min. Nakon toga DNK je precipitirana s 400 μL ohlađenog 98 % etanola. U nastavku je slijedio protokol proizvođača te je u finalnom koraku smanjen elucijski volumen na 50 μL BE. Koncentracija i čistoća genomske DNK određena je pomoću Qubit fluorometra.

Tehnika lančane reakcije polimeraze u realnom vremenu (qPCR)
Tehnikom lančane reakcije polimeraze u realnom vremenu (engl. Real Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) na uređaju Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, SAD) pomoću specifičnih TaqMan eseja (Applied Biosystems) kvantificirana je relativna količina bakterija u supragingivnom biofilmu, koje su važne za kariogeni potencijal (gram-pozitivni fakultativni anaerobi Streptococcus mutans i Streptococcus sorbinus kao bakterije visokog rizika za razvoj karijesa te Streptococcus salivarius kao njihov antagonist). Također su analizirani gram-negativni anaerobi Veillonella parvula i Aggregatibacter actinomycetemcomitans kako bi se opisale interakcije u biofilmu te poveznice s progresijom infekcije u gingivu i parodont. Specifičan TaqMan esej za kvantifikaciju 16s rRNK gena korišten je kao ekvivalent ukupnih bakterija prisutnih u dentalnom plaku.
Početnice i probe TaqMan eseja bile su specifične za glikoziltransferazni gtfB gen (S. mutans) i gtfT gena (S. sobrinus), transpozazni tnpA gen (S. salivarius), RNK polimerazni B rpoB gen (V. parvula) te leukotoksinski lktA gen (A. actinomycetemcomitans). Za kvantifikaciju ukupnih bakterija odabrana je konzervirana regija 16s rRNK gen.

Tablica 1. Sekvence početnice i probe
vrsta bakterija sekvenca cilj esej
S. mutans F 5' GCCTACAGCTCAGAGATGCTATTCT 3'
R 5' GCCATACACCACTCATGAATTGA 3'
Proba 5' TGGAAATGACGGTCGCCGTTATGAA 3' gtfB APWCYCU
S. sobrinus F 5' TTCAAAGCCAAGACCAAGCTAGT 3'
R 5' CCAGCCTGAGATTCAGCTTGT 3'
Proba 5' CCTGCTCCAGCGACAAAGGCAGC 3' gtfT APXGTWR
S. salivarius F 5' CACGCCATGCTGGAAGTG 3'
R 5' GCGATGAGCCAAGCTGAAG 3'
Proba 5 'TTAGCTGCTGCGTAGACTTCGTCT 3' tnpA APYMMGN
A. actinomycetemcomitans F 5' CAGCATCTGCGATCCCTGTA 3'
R 5' TCAGCCCTTTGTCTTTCCTAGGT 3'
Proba 5' TCGAGTATTCCTCAAGCATTCTCGCACG 3' lktA APKA6FU
V. parvula Custom TaqMan Assay, sekvenca nije dostupna rpoB APEPVGY
ukupne bakterije F 5' CGCTAGTAATCGTGGATCAGAATG 3'
R 5' TGTGACGGGCGGTGTGTA 3'
Proba '5 CACGGTGAATACGTTCCCGGGC 3' 16s rRNK APZTF2K

Reakcijska smjesa za RT-PCR (20 µL) sadržavala je 10 µL TaqMan Master Miksa, 1 µL pojedinačnog Custom TaqMan eseja (za svaku od odabranih bakterija), 4 µL vode i 5 µL DNK uzorka razrijeđenog na 0,5 ng/µl. Korišteni TaqMan esej obuhvaćao je specifične po narudžbi dizajnirane početnice za amplifikaciju gtfB, gtfT, tnpA, lktA i rpoB gena te gena za 16s rRNK kao kontrolu. Esej je, uz navedeno, imao po narudžbi dizajniranu TaqMan fluorescentno označenu probu s vezanom FAM-bojom i Q-prigušivačem. Uvjeti PCR reakcije na instrumentu 7500 Fast Real-Time PCR System bili su: inkubacija na 95 °C/10 min za aktivaciju Taq DNK polimeraze, zatim 95 °C/15 s za denaturiraciju DNK te 60 °C/1 min za vezanje početnica i ekstenziju. Uzorak se amplificirao kroz 50 ciklusa. Koristile su se pločice od 96 jažica u koje su pipetirani triplikati otopina za svaki gen (odnosno svaku pojedinačnu bakteriju) te kontrola bez predloška (non-template control) za sve gene.
Detekcija i kvantifikacija amplificiranih gena pojedinačnih bakterija te ukupne 16s rRNK mjerila se promjenom fluorescentnog signala specifično dizajniranih TaqMan proba. Do fluorescencije dolazi nakon hibridizacije te hidrolize probe na ciljnom mjestu nukleinske kiseline, stoga povećanje razine fluorescencije predstavlja razinu umnoženih gena. Rezultati se detektiraju pomoću granične vrijednosti (threshold vrijednosti – Ct-vrijednost, iz engl. threshold cycle) koja označava dovoljnu razinu fluorescencije nužnu za detekciju svakog uzorka te se uvijek postavlja u eksponencijalnoj fazi amplifikacije PCR produkta. Kada se umnoži dovoljno traženog gena DNK, detektira se fluorescentni signal, a Ct je ciklus umnažanja ili amplifikacije u kojem se ta detekcija dogodila. Veća Ct-vrijednost znači manju početnu količinu kopija traženog gena u uzorku, i obrnuto, manja Ct-vrijednost znači veću početnu količinu kopija traženog gena u uzorku.
Za izračunavanje relativne količine različite bakterijske populacije u odnosu na ukupnu bakterijsku masu kao referencu koristila se delta delta Ct metoda (2-ΔΔCt). ΔCt je izračunat kao razlika između vrijednosti Ct za određenu skupinu bakterija i vrijednosti Ct za ukupnu količinu bakterija (ekvivalent 16s rRNK). ΔΔCt je definiran kao razlika između ΔCt vrijednosti svakog tretmana (antiseptik i fluorid) te ΔCt vrijednosti kontrolne skupine. Vrijednosti izvedene iz 2−ΔΔCt metode pokazuju višestruke promjene broja bakterija u tretiranom uzorku u odnosu na one u kontrolnom uzorku. Vrijednost 2−ΔΔCt kontrolnih uzoraka jednaka je 1.

Sekvencioniranje sljedeće generacije (NGS)
Nakon analize dobivenih rezultata kvantitativnog RT-PCR-a, izabrano je po 4 reprezentativna uzorka svake od eksperimentalnih skupina te su pripremljeni za sekvencioniranje sljedeće generacije (engl. next generation sequencing, NGS). Ion Torrent tehnologija NGS bazira se na tehnologiji semikonduktorskih čipova te detekciji promjene pH tijekom inkorporacije pojedinog nukleotida u sekvencijskim reakcijama. Pripremljene knjižnice se fragmentiraju a pojedinačni se fragment poveže na 1 Ion Torrent kuglicu te amplificira dok kuglice nisu pune. Svaka od kuglica potom sjeda u milijune jažica na čipu. Čip se tijekom sekvenciranja prelijeva otopinom jednog od nukleotida A,T,C ili G, a promjena se pH detektira kao taj nukleotid u pojedinačnoj jažici te pretvara u digitalni signal A,T,C ili G. Izolirana DNK svakog od uzoraka razrijeđena je tako da je u amplifikacijsku PCR mješavinu dodano 3,5 ng DNK. Amplificirane su 2. – 9. hipervarijabilne regije 16s rRNK gena s Ion 16S Metagenomics kitom (Thermo Fisher, Waltham, SAD) prema uputama proizvođača. Nakon toga su pročišćeni te udruženi amplikoni 2. – 9. hipervarijabilne regije 16s rRNK svakog od uzorka te izmjerena koncentracija. Za izradu barkodiranih knjižnica korišteno je 150 ng svakog od udruženih amplikona pomoću Ion Plus Fragment Library kita (Thermo Fisher, Waltham, SAD) prema uputama proizvođača. Zatim su pripremljene knjižnice pročišćene od nevezanih adaptera i barkodova. Koncentracije barkodiranih knjižnica provjerene su pomoću Ion Universal Library Quantitation kita (Thermo Fisher, Waltham, SAD). Nakon toga slijedio je emulzijski PCR s 10 pM razrijeđenjem knjižnica svih uzoraka poliranih u 12 µL te priprema osnovnog predloška za sekvenciranje s Ion OneTouch™ 2 System uređajem te Ion PGM™ Hi-Q View Kitom (Thermo Fisher, Waltham, SAD). Koncentriranje Ion Sphere kuglica – ISP (ispiranje praznih i poliklonalnih ISP-a) rađeno je s Ion OneTouch ES kitom te instrumentom Ion OneTouch 2 (Thermo Fisher, Waltham USA) prema uputama proizvođača. Sekvenciranje se potom napravilo s Ion PGM™ Hi-Q View Sequencing Kitom na Ion PGM™ System uređaju koristeći Ion 316™ čip. Analiza dobivenih rezultata napravljena je pomoću Ion Reporter softvera.

Etički aspekti istraživanja
Istraživanje je bilo provedeno u skladu sa svim primjenjivim smjernicama uz poštivanje Osnova dobre kliničke prakse. Medicinski podatci prikupljani su u skladu s bioetičkim standardima. Za uključene ispitanike osigurana je privatnost i zaštita tajnosti podataka. U skladu s Nürnberškim kodeksom, najnovijom revizijom Helsinške deklaracije te ostalim mjerodavnim dokumentima osiguralo se poštivanje temeljnih etičkih i bioetičkih principa – osobni integritet (autonomnost, pravednost, dobročinstvo i neškodljivost).
Lokalna etička povjerenstva dala su pozitivno mišljenje o istraživanjima uz pisani informirani pristanak svih ispitanika:
1. Etičko povjerenstvo Kliničkog bolničkog centra Rijeka, ur. broj: 2170-29-02/1-14-2
2. Etičko povjerenstvo Kliničkog bolničkog centra Rijeka, ur. broj: 2170-29-02/1-20-2
3. Etičko povjerenstvo Medicinskog fakulteta u Rijeci, ur. broj: 2170-24-01-17-04
3. Etičko povjerenstvo Medicinskog fakulteta u Rijeci, ur. broj 2170-24-01-14-053.
4. Etičko povjerenstvo Fakulteta dentalne medicine Rijeka, ur. broj: 2107-57-006-20-1

Statistička analiza
Podatci su statistički obrađeni, ovisno o raspodjeli dobivenih podataka. Provjera normalnosti distribucije i homogenosti varijanci unutar skupina učinjena je pomoću Kolmogorov-Smirnovljevog i Shapiro-Wilkovljevog testa. Za podatke koji su slijedili normalnu distribuciju korištena je analiza varijance i Student-Newman-Keuls post-hoc test, a u suprotnom Kruskal-Wallisov test s Mann-Whitneyevim testom za višestruke usporedbe uz Bonferronijevu korekciju. Za analize prije i nakon interevencije korišteni su t-test za zavisne uzorke i Wilcoxonov test. Za procjenu povezanosti promjena korištena je Pearsonova ili Spearmanova korelacija, ovisno o distribuciji podataka. Vrijednosti p < 0,05 smatrale su se statistički značajnima.